AUFGABE 2: Enzymaktivitätsbestimmung in Serum und Plasma LDH, GOT, CK, gamma-GT und ChE für die Leberfunktionsdiagnostik

A) Pathophysiologisches Lernziel

Die Enzyme des Plasmas lassen sich hinsichtlich Funktion und Herkunft in drei Gruppen einteilen:

  1. Die plasmaspezifischen Enzyme: Hierzu gehören das System der Blutgerinnung, z.B. Prothrombin - Thrombin, und die Cholinesterase. Ihr normaler Wirkungsort ist das Plasma, bei Schädigung ihrer Herkunftsorgane sinkt daher ihre Aktivität im Plasma. Bei Vergiftung mit organischen Phosphorverbindungen (Pflanzenschutzmittel) nimmt die Aktivität der Cholinesterase ab. Die Untersuchung der Enzyme der Blutgerinnung (z.B. Aktivität des Thrombins) wird wegen einiger methodischer und enzymkinetischer Besonderheiten der Meßtechnik (Gerinnungszeitmessung) in einem eigenen Kapitel Blutgerinnung (Kap. 9) behandelt.
  2. Die Sekret-Enzyme: Beispiele hierfür sind die Pankreas-Amylase und Prostata-Phosphatase, die bei der Sezer-nierung durch die exokrinen Drüsen auch in das Blut übertreten, dort aber keine Funktion haben.
  3. Die zell- und organspezifischen Enzyme: Dies sind Enzyme des Zellstoffwechsels, die bei einer Zellschädigung austreten und daher dann vermehrt im Plasma auftreten. Soweit sie nicht als Hauptkettenenzyme allen Zellen gemeinsam sind, können sie organspezifisch sein. Ihr Nachweis im Plasma erlaubt somit Rückschlüsse auf das Herkunftsorgan. Im Plasma sind sie ebenfalls funktionslos, da hier ihre normalen Substrate und Cosubstrate fehlen. Die absoluten Konzentrationen der Enzyme im Plasma sind sehr gering (10-4 g/l gegenüber 70 g/l Gesamtprotein), so daß sie nur als Aktivitäten über die Geschwindigkeit ihres Substratumsatzes bestimmt werden können.

In dieser Aufgabe werden zunächst nur Beispiele der dritten Gruppe mehr oder weniger organspezifischer Enzyme behandelt. Ihre Auswahl erfolgte einerseits im Hinblick auf ihre klinisch-diagnostische Bedeutung, andererseits unter didaktischen Gesichtspunkten zum Erlernen des Meßprinzips und der Beurteilung der Ergebnisse nach methodischen und physiologischen Kriterien.

  1. Lactat-Dehydrogenase (LDH) kommt in allen Zellen vor, d.h. sie ist nicht organspezifisch. Erhöhungen der LDH-Aktivität sind deshalb bei zahlreichen lokalisierten und Allgemeinerkrankungen zu finden. LDH tritt als tetrameres Enzym in fünf Isomeren aus den Monomeren H und M auf; aus der zusätzlichen Bestimmung der Anteile der Isoenzyme mittels Elektrophorese kann auf eine vorwiegende Beteiligung von Leber/Skelettmuskel oder Herzmuskel/Niere geschlossen werden. Erythrozyten enthalten hohe LDH-Aktivitäten, daher ist eine Messung bei hämolytischen Seren illusorisch. Auch Thrombozyten setzen bei der Gerinnung LDH frei, so daß Serum stets eine höhere LDH-Aktivität als Plasma aufweist. Beim Rind ist die LDH-Aktivität im Serum besonders hoch.
  2. Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) ist zwar in allen Geweben vertreten, jedoch hat insbesondere der Herzmuskel höhere Aktivitäten als die Leber. Somit dient GOT zusammen mit GPT (s.u.) speziell in der Humanmedizin zur Differentialdiagnose einer akuten Herzmuskelschädigung (Infarkt) gegenüber Lebererkrankungen, bei denen beide Aktivitäten proportional verlaufen (vgl. Diskussion Enzymmuster, Enzymquotienten, vgl. Biochemisches Praktikum Transaminierung).
  3. Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) ist ein relativ leberspezifisches Enzym, die Erhöhung ihrer Aktivität z.B. bei Hepatitiden ist unterschiedlichster Genese. Herz, Muskel, Niere und Erythrozyten haben vergleichsweise geringe Aktivitäten und beeinträchtigen daher die Diagnose wenig.
  4. Creatin-Kinase (CK) kommt vorwiegend in Herz- und Skelettmuskulatur vor. Erhöhungen im Serum können daher bei Herzmuskelerkrankungen (Infarkt) oder ausgedehnten systemischen Skelettmuskelerkrankungen auftreten (Muskeldystrophie, Myositis, Vitamin E-Mangel).
  5. gamma-Glutamyl-Transferase (gamma-Transpeptidase, gamma-GT) ist ein leberspezifisches Enzym, das besonders in den Epithelien der intrahepatischen Gallenwege vorkommt. Auffällige Erhöhung findet man bei alkoholtoxischer Leberschädigung und bei posthepatischem Ikterus (Cholestase), bei denen die Transaminasen nicht im gleichen Maß erhöht zu sein brauchen (gamma-GT/GOT-Quotient; vgl. Aufgabe 12: Blutalkohol, Ethanol-Elimination, sowie Vorlesung Pharmakologie, Toxikologie des Ethanols).
  6. Cholinesterase (ChE) spaltet verschiedene Ester des Cholins. Da sie ein plasmaspezifisches Enzym ist, sinkt ihre Aktivität bei Schädigung des Herkunftsorgans, der Leber, bei Hepatitiden oder Vergiftung.

Für die klinisch-diagnostische Bewertung von Enzymaktivitätsmessungen sind allgemein folgende Punkte zu berücksichtigen:

  1. Die biologische Verteilung, d.h. die physiologische Streubreite ist in den meisten Fällen sehr groß. Die Inter-pretation als pathologische Abweichung sollte immer im Zusammenhang mit anderen klinischen Daten erfolgen. Zur Diagnostik trägt besonders die Beurteilung von Enzymmustern und Enzymquotienten bei (s.Abb. 2.2, S. 13).
  2. Enzymaktivitäten sind nicht normalverteilt, sondern log-normalverteilt, d.h. schief und sehr breit. Die häufig anzutreffende Angabe von Mittelwerten und Streuungen nach einer Normalverteilung ist unsinnig. Richtiger als Streuungsmaß ist die Angabe eines Streufaktors. Wegen der breiten Verteilung ist auch erst für Abweichungen um ein Vielfaches des Mittelwertes eindeutig die Interpretation als pathologisch erlaubt (vgl. Diskussion log-Normalverteilung).
  3. In vivo werden die Enzyme im Plasma nach einer Reaktion 1. Ordnung, d.h. exponentiell eliminiert, die Halbwertszeiten liegen im Bereich von 2 - 12 Stunden. Diese an sich schnelle Elimination ermöglicht die Beurteilung eines Heilungsprozesses aus dem Abklingen der Aktivität. Aktivitäten im Serum beschreiben somit immer ein aktuelles Bild.
  4. In vitro ist andererseits die Erhaltung der Aktivität im Serum damit nicht gleichlaufend und meist nicht so kritisch, wie daraus zu erwarten wäre. Aktivitätsmessungen können daher bei richtiger Probenbehandlung (z.B. kühlen oder einfrieren) meist ohne wesentlichen Verlust innerhalb 24 Stunden ausgeführt werden.

B) Methodisches Lernziel

Klinisch-diagnostische photometrische Enzymaktivitätsbestimmungen
(vgl. Vorlesung Biochemie, Enzymkinetik; vgl. enzymatische Substratbestimmung, Enzyme der Blutgerinnung).

Die katalytische Aktivität ist ein Maß für die Leistung eines Enzyms, stellvertretend für die sonst nicht meßbare Stoffmenge des Enzyms. Die alte Einheit U (= unit) der Aktivität ist der Umsatz von 1 µmol Substrat pro Minute unter definierten Bedingungen (1 U = 1 µmol/min). Nach dem SI-Einheitensystem gilt jedoch als Einheit katal (1 kat = 1mol/s).

Der Proportionalitätsfaktor zwischen katalytischer Aktivität A und Stoffmenge M eines Enzyms ist die Wechselzahl W.


Formel 2

Die bisher gebräuchliche Wechselzahl wird ersetzt durch die auf Enzymmenge (mol) bezogene, molare katalytische Aktivität (kat/mol).

Als Enzymkonzentrationsangabe bezieht man die Aktivität auf das Volumen Flüssigkeit (Plasma, Serum), für das die Bestimmung erfolgt. Hierfür galt bisher der Ausdruck "Volumenaktivität" U/l (µmol(Substrat)/(minl)). Entsprechend gilt nach dem SI-System als Konzentrationsangabe der katalytischen Aktivität kat/l (mol(Substrat)/(sl)). Fälschlich wird in der Medizin häufig der Ausdruck "Aktivität" und "Volumenaktivität" für die Konzentration synonym gebraucht.

Notwendige Voraussetzungen für sinnvolle Aktivitätsangaben sind folgende Bedingungen:

  1. Substrat- und Cosubstratsättigung, d.h. deren Konzentration darf die Geschwindigkeit des Umsatzes nicht limitieren (für S >> KM wird v proportional E).
  2. Definierte, gegebenenfalls optimale Konzentration von Aktivatoren
  3. Bei Folgereaktionen (sog. zusammengesetzte Tests) muß die eigentliche Meßreaktion der geschwindigkeitsbestimmende Schritt sein.
  4. Die Messung muß im linearen Teil der Umsatzkurve, d.h. unter "Anfangsbedingungen" erfolgen.
  5. Allgemein ist als Bezugstemperatur 25C festgelegt worden. Andere Meßtemperaturen müssen angegeben werden (z.B. Aldolase bei 37C).

Da im Praktikum nicht mit thermostatisierten Küvetten und Photometern gemessen werden kann, ergeben sich Aktivitätsangaben für Raumtemperatur. Sie können nur unter der Bedingung, daß der Temperaturkoeffizient der Reaktion bekannt ist und in einem nicht zu großen Temperaturbereich gemessen wird, auf eine Bezugstemperatur umgerechnet werden. Der Temperaturkoeffizient Q10 ist das Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten bei 10 Grad Temperaturunterschied. Für Q10 = 2 ergibt sich daraus die Formel


Formel 3

und in vereinfachter Form


Formel 4

wobei AT die bei der Temperatur T gemessene Aktivität und DeltaT die Temperaturdifferenz gegen die Solltemperatur 25C sind.


Hier im Praktikum dient diese Abschätzung nur dazu, das Ausmaß eines Temperaturfehlers zu erfassen. Selbstverständlich ist unter korrekten Routinebedingungen eines klinischen Labors für Aktivitätsbestimmungen mit einem thermostatisierten Photometer bei der Solltemperatur zu arbeiten. Aus der beschriebenen Temperaturabhängigkeit der Reaktion ergibt sich für plusminus 1C Abweichung ein Fehler von ca. plusminus 10 %

  1. Definierte, jedoch nicht notwendigerweise "optimale" Werte für pH, Pufferkonzentration und Kapazität.
  2. Im Testansatz muß die Enzymkonzentration genügend gering sein, damit die gemessene Umsatzgeschwindigkeit der Aktivität noch proportional ist. Hierzu ist die Probe evtl. zu verdünnen, wenn der Meßbereich des Tests überschritten wird.
  3. Die Umrechnung der gemessenen (konzentrations-proportionalen) Extinktionsänderung DeltaE/Deltat in die (massen-proportionale) Aktivität DeltaS/Deltat erfolgt unter Berücksichtigung des Testvolumens und des molaren Extinktionskoeffizienten des chromogenen (Co)-Substrates, z.B.

epsioln340 nm

epsioln365 nm

l / (mol cm)

NADH

6,3

3,4

103

NADPH

6,3

3,5

103

Durch Bezug auf das eingesetzte Enzymvolumen (Serum, Plasma) erhält man die eigentliche Volumen-aktivität. Für die standardisierten, kommerziellen Tests sind diese Werte in dem sog. "Umrechnungsfaktor" F zusammengefaßt.


Formel 5

f = Verdünnungsfaktor der Probe im Ansatz; F = Gesamt-Umrechnungsfaktor


Bei den standardisierten optischen Verfahren wird die Reaktionsfolge so geführt, daß die Messung an Verbrauch oder Bildung eines geeigneten chromogenen (Co)-Substrates oder Produkts erfolgt. Natürliches chromogenes Substrat von Dehydrogenasen ist z.B. das System NAD+ / NADH. Chromogene Substrate für Phosphatasen (vgl. Biochemisches Praktikum), Esterasen, Transpeptidasen (vgl. gamma-GT) sind z.B. p-Nitrophenylester, für Peroxidasen z.B. ABTS, Dianisidin, Benzidin (vgl. enzymatische Cholesterolbestimmung).


Daraus ergibt sich zwanglos die Reihenfolge der hier aufgeführten Tests:

1. LDH
Einfacher Test, Messung im UV


Pyruvat + NADH + H+Lactat + NAD+


Messung des NADH-Verbrauchs aus der Extinktionsabnahme bei 340 nm (Absorptionsmaximum) oder 365 nm (Hg-Linie).

2. GPT
Zwei Folgereaktionen, zusammengesetzter Test


a) L-Ala- + aKG Pyruvat + L-Glu (Meßreaktion)


b) Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+ (Indikatorreaktion)


3. GOT (AST)

a) L-Asp + a-Oxoglutarat Oxalacetat + L-Glu


b) Oxalacetat + NADH + H+ Malat + NAD+



4. CK
Drei Folgereaktionen, Messung der NADPH-Bildung aus der Extinktionszunahme, ADP wird in der zweiten Reaktion regeneriert.

a) Creatinphosphat + ADPCreatin + ATP

b) ATP + D-GlucoseADP + G6P

c) G6P + NAD6-Phosphogluconat + NADH


5. gamma-GT
Einfacher Farbtest, Messung im sichtbaren Bereich (405 nm)


gamma-Glu-Carboxy-Nitroanilid + Gly-Gly-NH2Amino-Nitrobenzoat + Glu-Gly-NH2



6. ChE
Zwei Folgereaktionen; die zweite Reaktion ist eine nicht-enzymatische und nicht-limitierende chromogene Reaktion


a) Butyrylthiocholin + H2OThiocholin + Butyrat

b) Thiocholin + Dithio-nitrobenzoesäure5-Thio-2-Nitrobenzoesäure


Reaktionsgemische
liegen fertig vor, angegebene Konzentrationen beziehen sich auf den Meßansatz

  1. LDH: Reag. A: Phosphatpuffer pH 7.5, 50 mmol/l; NADH 0,18 mmol/l
    Reag. B: Pyruvat 0,60 mmol/l
    B + A = 1 + 25
  2. GOT: 0,18 mmol NADH, 12 mmol/l a-Oxoglutarat, 200 mmol/l L-Aspartat, 1,2 kU/l LDH, 0,6 kU/l MDH, 80 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,4
  3. CK: Creatinphosphat 30 mmol/l, ADP 2 mmol/l, AMP 5 mmol/l, NAD 2 mmol/l, N-Acetyl-L-Cystein 20 mmol/l, HK 3000 U/l, G6PDH 2000 U/l, Mg2+ 10 mmol/l, D-Glucose 20 mmol/l, Di(adenosin 5')pentaphosphat 10 mmol/l, EDTA 2 mmol/l, Puffer pH 6,7, 0,05% NaN3, Stabilisatoren, Füllstoffe
  4. gamma-GT: 4,36 mmol/l L-g-Glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilid, 60 mmol/l Glycylglycin, 0,05% NaN3, Puffer, Füllstoffe
  5. ChE: Puffer, pH 7,2, 0,25 mmol/l 5,5'-Dithio-bis-nitrobenzoesäure, 5 mmol/l Butyryl-thiocholinjodid

Geräte
Mikroliterpipetten, Halbmikro-Durchflußküvette, Photometer


Beurteilung der Verteilung von Enzymaktivitäten

In der Klinik spielt die Beurteilung von Laborwerten individueller Patienten eine wichtige Rolle. Um Laborwerte sinnvoll für die Diagnostik nutzen zu können, müssen zunächst aus einer möglichst großen Population gesunder bzw. eindeutig erkrankter Tiere die Art der Verteilungen, Mittelwerte und Streuungen bekannt sein, um zwischen "normal" und "pathologisch" entscheiden zu können. In Überschneidungsbereichen müssen die Grenzen definiert werden, da dort hohe Irrtumswahrscheinlichkeiten für "falsch positiv" und "falsch negativ" vorliegen, die den Wert des diagnostischen Parameters begrenzen.

Biologische Verteilungen sind in vielen Fällen, wie hier am Beispiel von Enzymaktivitäten gezeigt, nicht symmetrisch (d.h. nicht normalverteilt). Oft können sie durch Logarithmieren des Merkmals symmetrisch gemacht werden (log-normalverteilt).

Schiefe Verteilungen (hier Enzymaktivitäten im Serum) ergeben sich im Blut durch das wechselnde Fließgleichgewicht zwischen Zufluß (aus den Zellen) und Abfluß (Abbau, Ausscheidung).

Das Problem der korrekten Behandlung schiefer Verteilungen stellt sich häufig bei der Erstellung sogenannter Normalwerte für die Klinik, bei der Auswertung von Tierversuchen oder bei Dissertationen.

Um in der klinischen Diagnostik die Angabe von "Normalwerten" oder "Normalbereichen" von Enzymaktivitäten und ihren Änderungen z.B. im Verlauf einer Erkrankung als signifikant oder nicht-signifikant einschätzen zu lernen, sollen am Beispiel der GOT die Eigenschaften log-normaler Verteilungen aufgezeigt werden.

  1. Bilden Sie in den Wertetabellen die prozentualen Häufigkeiten (%) und die Summenhäufigkeiten (S%) durch Aufsummieren aller relativen Häufigkeiten von Zeile zu Zeile bis 100 %.
  2. Tragen Sie die Summenhäufigkeiten und die relativen Häufigkeiten auf Einfach-Logarithmenpapier auf (log-Normalverteilungen werden so symmetrisch dargestellt).
  3. Tragen Sie die Summenhäufigkeiten und die relativen Häufigkeiten jeweils auf linearem und logarithmischem Wahrscheinlichkeitsnetz auf (log-Normalverteilungen ergeben eine Gerade im logarithmischen Netz).
  4. Diskutieren Sie anhand dieser vier Darstellungen die Eigenschaften der log-Normalverteilung im Vergleich zur Normalverteilung (Mittelwerte, Streuungsmaße).
  5. Diskutieren Sie die diagnostische Bewertung von Enzymaktivitätsbestimmungen, Enzymmustern, Enzymquotienten.

Abbildung 2.1 a
Abbildung 2.1 b

Abb. 2.1: schiefe Verteilungen der GOT-Aktivitäten im Serum gesunder Frauen und Männer


Abbildung 2.2

Abb. 2.2: "Spektren" von Enzymaktivitäten bei verschiedenen Lebererkrankungen gegenüber gesunder Leber. (Beachte die logarithmische Auftragung der Aktivitäten!)


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